Главная > Автореферат диссертации


РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ

им. И.М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

БУРМАКИН

Михаил Викторович

ВСАСЫВАНИЕ БЕЛКОВ В ТОНКОМ КИШЕЧНИКЕ В ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ У КРЫС

03.00.13 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург

2007

Работа выполнена в лаборатории физиологии почки и водно-солевого обмена Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Научный руководитель

Академик РАН Ю.В. Наточин

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор А.В. Смирнов

доктор медицинских наук, профессор А.Н. Шеповальников

Ведущее учреждение

Санкт-Петербургский государственный университет

Защита состоится «_13_» __февраля__ 2007 г. в _11_ часов

на заседании диссертационного совета Д 002. 127. 01 по защите диссертаций

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

по адресу: Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке

Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Автореферат разослан _28_ _декабря__ 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук М.Н. Маслова

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Согласно существующим представлениям белки в желудочно-кишечном тракте гидролизуются пептидазами в процессе пищеварения до аминокислот, ди- и трипептидов, которые при участии переносчиков абсорбируются клетками тонкой кишки в кровь (Adibi, 1997; Daniel, 2004). Считается, что нерасщепленные белки способны всасываться только при некоторых патологических состояниях, таких как шок, сепсис, панкреатическая недостаточность, воспалительные заболевания кишечника, аллергические заболевания (Fourrier, 1997; Knippels, Penninks, 2002; Bannon, 2004). Известно, что возможно всасывание интактных белков в желудочно-кишечном тракте на ранних стадиях постнатального развития млекопитающих (Зуфаров и др., 1974; Henning, 1987; Bendayan et al., 1994; Mostov, 1994). В то же время имеются данные, которые свидетельствуют о всасывании белков и у взрослых млекопитающих (Мазо и др., 1989; Dickenson et al., 1999). Недавно было показано, что нонапептид аргинин-вазопрессин, введенный в изолированную по методу Тири-Велла петлю тонкой кишки крыс, всасывается без гидролиза с сохранением антидиуретической активности (Наточин и др., 2003). Остается неясной судьба пептидов и белков, которые абсорбируются в кишке и поступают во внутреннюю среду организма в нерасщепленном виде. В связи с этим возникают следующие вопросы: способны ли клетки тонкой кишки у животных на начальных этапах онтогенеза всасывать непищевые чужеродные белки и сохраняется ли эта способность у взрослых особей, в каком органе происходит дальнейший метаболизм белков, и функционируют ли эти механизмы у млекопитающих и амфибий. Ответу на эти вопросы посвящено данное экспериментальное исследование.

Цель исследования. Цель работы заключалась в изучении возможности всасывания в тонкой кишке у крыс и лягушек нерасщепленного белка на примере зеленого (GFP) и желтого флюоресцентных белков (YFP), а также в выяснении роли почек в дальнейшей их утилизации на различных этапах постнатального онтогенеза.

Задачи исследования.

  1. Разработка метода исследования метаболизма GFP и YFP в организме у крыс и лягушек после введения этих белков в просвет тонкой кишки.

  2. Изучение всасывания GFP и YFP в кишке у крыс в различные периоды постнатального онтогенеза и у взрослых лягушек.

  3. Исследование накопления GFP и YFP в почке и печени после их введения в кишечник у лягушек и у крыс.

  4. Исследование всасывания GFP в тонкой кишке у крыс с развивающейся почечной недостаточностью (после удаления 5/6 почек) и аккумуляции GFP в оставшейся почке.

Научная новизна. Разработан новый метод для исследования всасывания и накопления в организме поступившего во внутреннюю среду нерасщепленного чужеродного белка на примере флюоресцентных белков. Впервые показано, что GFP и YFP после их введения зондом в желудок крыс или лягушек или непосредственно в тонкую кишку всасываются энтероцитами, а затем аккумулируются в эпителиальных клетках проксимальных канальцев нефрона. Установлено, что в раннем постнатальном онтогенезе у крыс всасывание флюоресцентных белков в кишке происходит интенсивнее, чем у взрослых животных. У частично нефрэктомированных крыс всасывание чужеродных белков и их накопление в почке снижено по сравнению с контролем.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. GFP и YFP могут всасываться в тонкой кишке у крыс и лягушек нерасщепленными.

  2. Всасывание GFP и YFP в энтероцитах происходит интенсивнее у крыс в ранние периоды постнатального онтогенеза, чем у взрослых животных.

  3. Исследованные белки после их введения крысам и лягушкам зондом в желудок или в тонкую кишку накапливаются в эпителиальных клетках проксимального канальца почки, но не обнаруживается в клетках печени.

  4. У крыс через 2 месяца после удаления 5/6 почек снижается накопление GFP в клетках проксимального отдела нефрона.

Научно-практическое значение работы. Результаты диссертации используются в курсах лекций по физиологии, читаемых на медицинском факультете Санкт-Петербургского государственного университета.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всероссийской конференции молодых исследователей “Физиология и медицина” (Санкт-Петербург, 2005), I съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), XIII международном совещании и VI школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликована статья в отечественном реферируемом журнале и тезисы 3-х докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, 5 глав результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 259 источников. Диссертация иллюстрирована 4 таблицами и 29 рисунками.

Материалы и методы исследования

Исследование выполнено на крысах (530 животных) и лягушках (60 особей). В опытах на крысах использованы взрослые самки линии Вистар и крысята в возрасте 5, 12 и 25 дней, а также крысы-самцы с частичной нефрэктомией. До экспериментов все животные содержались в стандартных условиях. В экспериментах были использованы самцы лягушек Rana temporaria, опыты на лягушках проводили в мае, животные содержались в холодильной камере при температуре +5°С.

В экспериментах in vivo ненаркотизированным крысам зондом в желудок вводили GFP (0,034, 0,34, 3,4, 6,8 мкг/мл), YFP (0,00365, 0,0365, 0,365, 3,65, 7,3 мкг/мл) из расчёта 100 мкл на 150 г массы животного на 0.01 М PBS-буфере (рН 7,3). В других опытах крыс наркотизировали путем внутрибрюшинной инъекции раствора 0,75 % нембутала и 0,37 % хлоралозы из расчета 0,5 мл на 100 г массы животного. Этим крысам вскрывали брюшную полость по средней линии живота, затем разрезали стенку пищевода в нижней его части и через разрез вводили зонд из полиэтилена, через который вливали растворы GFP и YFP или флюоресцеин (8 мкг/мл) в аналогичных количествах.

Через различные интервалы времени (каждые 3 мин до 33 мин, а также через 60, 120, 180, 240 и 300 мин) после введения белков перорально или непосредственно в кишку, крыс декапитировали. Затем разрезали брюшную стенку по средней линии живота и выделяли для фиксации отрезок тонкой кишки длиной 2 см на расстоянии 20 см от двенадцатиперстной кишки, отрезок толстой кишки длиной 2 см на расстоянии 1-2 см от слепой кишки, а также фрагмент коркового вещества почки или фрагмент печени. В контрольных опытах животным вводили по 100 мкл на 150 г веса фосфатного буфера (PBS) без белков.

В опытах in vitro крыс декапитировали, и выделяли такой же, как описано выше, участок тонкой кишки. После этого на дистальную часть каждого из отрезков кишки накладывали лигатуру, а в просвет кишки вводили раствор GFP и YFP в тех же количествах, что и в опытах in vivo. Изолированные отрезки кишки помещали в раствор Рингера для теплокровных (37oС). Далее через каждые 3 минуты после начала инкубации фрагменты кишки фиксировали для морфологических исследований.

Лягушкам in vivo вводили через рот в желудок резиновый зонд и вливали 100 мкл раствора GFP на 150 г массы животного в концентрации 0,34 мкг/мл на 0.01 М PBS-буфере (рН 7,3). Через каждые 3 мин до 33 мин, а также через 120 и 300 мин после введения GFP лягушек обездвиживали, после чего разрезали брюшную стенку по средней линии живота и выделяли участок тонкой кишки или фрагмент почки для морфологических исследований.

Кусочки ткани фиксировали, замораживали и готовили из них гистологические срезы в криостате Leica CM1510 (Leica, Германия). Препараты изучали в флюоресцентном микроскопе TSC SL (Leica, Германия) с конфокальной приставкой DM R (Leica, Германия), используя набор фильтров BP 450-490 и LP 515. На полученных имиджах с помощью компьютерной программы Image Tool III измеряли интенсивность флюоресценции клеток эпителия тонкой кишки и проксимального сегмента нефрона. Значение интенсивности выражали в условных единицах, которые рассчитывали как соотношение флюоресцирующих точек (пикселей) в пределах данного участка к несветящимся (шкала от 0 до 256). Сопоставляли интенсивность флюоресценции на равных по площади участках эпителия в разных вариантах опытов.

Данные обрабатывали статистически и представляли в виде M ± m. Для сравнения и оценки достоверности различий использован t-тест Стьюдента. Использовали компьютерную программу Microsoft Excel Microsoft Office 2000.

Результаты исследования

Исследование слизистой оболочки тонкой кишки и эпителия почки крыс после введения зеленого и желтого флюоресцентных белков в кишку. Для того, чтобы исключить возможность токсического воздействия маркерных белков на ткани кишки и почки, были проведены предварительные эксперименты, в которых GFP и YFP применяли в различных концентрациях, а именно: 0,034, 0,34, 3,4, 6,8 мкг/мл – для GFP; 0,00365, 0,0365, 0,365, 3,65, 7,3 мкг/мл – для YFP. Было установлено, что после введения в кишку крысы этих белков в концентрации 0,034 мкг/мл для GFP и 0,00365 мкг/мл для YFP, флюоресценции, отличающейся от фоновой, в энтероцитах не выявлялось. При использовании белков в концентрации от 3,4 мкг/мл для GFP и от 0,365 мкг/мл для YFP обнаружено увеличение количества бокаловидных клеток в эпителии кишки, и повышена вакуолизация в эпителиальных клетках проксимального канальца нефрона, что считается проявлением реакции эпителия на неблагоприятное неспецифическое воздействие (Блюгер и др., 1970; Вайсброт, 1972). Для дальнейшей работы были использованы концентрации 0,34 мкг/мл для GFP и 0,0365 мкг/мл для YFP при этом сохранялась целостность структур клеток эпителия и определялась специфическая флюоресценция.

Всасывание GFP и YFP в тонкой кишке. После введения в просвет кишки 150 мкл на 100 г массы животного GFP и YFP специфическая флюоресценция клеток кишечного эпителия у крыс всех возрастных групп выявлялась уже через 3 мин. У взрослых крыс увеличение интенсивности свечения характеризовалось наличием максимума флюоресценции на 21 мин после введения маркерных белков в кишку (GFP - 18,7 + 2,3 усл. ед.; YFP - 33,7 + 5,2 усл. ед.) с последующим понижением интенсивности свечения эпителиального слоя тонкой кишки (рис. 1). У 25-дневных крыс после введения GFP и YFP в кишку интенсивность свечения энтероцитов оказалась такой же, как у взрослых крыс (рис. 1). В опытах на 12-дневных крысятах специфическая флюоресценция GFP и YFP, выявляемая через 3 мин, была несколько выше ее средних значений у взрослых и 25-пятидневных крыс (р<0,001). Максимум флюоресценции у 12-дневных крысят приходился на 15 мин после введения белка и равнялся 59 + 6,8 усл. ед. для GFP и 58,8 + 6,3 усл. ед. для YFP. У 5-дневных крысят максимум флюоресценции наблюдался еще раньше – уже на 9 мин после введения флюоресцентных белков, составив 90,0 + 10,5 усл. ед. для GFP и 94,0 + 10,9 усл. ед. для YFP. Значения максимумов у крыс всех возрастных групп достоверно отличались друг от друга (p<0,001). Следовательно, чем меньше возраст крысы, тем быстрее и активнее происходит всасывание белка в кишке.

Распределение флюоресценции в энтероцитах после введения GFP и YFP в просвет кишки. Флюоресценция цитоплазмы эпителиальных клеток тонкой кишки была диффузной и выявлялась в случае GFP в виде зеленого свечения, а для YFP в виде желтого свечения, как это видно рис. 2. Наиболее интенсивная флюоресценция наблюдалась в энтероцитах у пятидневных крысят. Во всех вариантах экспериментов флюоресценция отсутствовала в области межклеточных контактов. Интенсивность свечения маркерных белков в апикальной области цитоплазмы энтероцитов во всех вариантах была примерно в 1,5 раза больше, чем в базальной.

А

Б

*

*

*

**

**

**

**

*

Рис. 1. Зависимость интенсивности флюоресценции клеток эпителиального слоя верхней трети ворсинки тонкой кишки от времени после введения GFP (А) и YFP (Б) в кишку у крыс разного возраста.

Абсцисса – время после введения GFP или YFP (100 мкл на 150 г массы животного), мин. Ордината – интенсивность флюоресценции в условных единицах. Достоверность отличий по отношению к взрослым крысам: * - р<0,001; ** - р<0,01.

Рис. 2. Флюоресценция энтероцитов на максимуме эффекта после введения в просвет тонкой кишки раствора GFP взрослым крысам (А) и крысятам в возрасте 25 (Б), 12 (В) и 5 дней (Г).

Условные обозначения: мк – межклеточный контакт, ц – цитоплазма, щк – щеточная кайма, я – ядро. Время после введения GFP: 21 мин (А, Б), 15 мин (В), 9 мин (Г). Масштабная линейка на всех имиджах равна 10 мкм.

Флюоресценция после введения белка не была обнаружена в бокаловидных клетках эпителия кишки. В качестве контроля в этих экспериментах исследовали флюоресценцию в эпителии тонкой кишки без введения маркерных белков, в этом случае обнаруживалось только слабое неспецифическое свечение. В опытах с введением этих белков в просвет кишки специфической флюоресценции в клетках эпителия толстой кишки обнаружено не было.

Всасывание зеленого флюоресцентного белка в тонкой кишке лягушки. В опытах на лягушках показано, что специфическая флюоресценция GFP в эпителии тонкой кишки появлялась, как и у крыс, через 3 мин после его введения в просвет кишки. Максимальное свечение GFP в энтероцитах наблюдалось через 15 мин после введения маркерного белка в кишку (29,0 + 3,6 усл. ед.). К 33 мин интенсивность свечения в клетках эпителия тонкой кишки лягушки снижалась до уровня контрольных значений.

Динамика интенсивности свечения GFP в клетках кишечного эпителия лягушек была сходна с таковой у 12-дневных крысят (рис. 3).

Рис. 3. Интенсивность флюоресценции эпителиального слоя верхней трети ворсинки энтероцитов тонкой кишки в зависимости от времени после введения GFP у лягушек. Абсцисса – время (100 мкл на 150 г массы животного), мин. Ордината – интенсивность флюоресценции в условных единицах.

Однако максимум флюоресценции у лягушек достоверно ниже (р<0,001), чем у 12-дневных крысят. Флюоресценция после введения GFP в просвет кишки в энтероцитах тонкой кишки лягушек имела диффузный характер, как и у крыс. В экспериментах без введения GFP флюоресценция представлена в виде фонового свечения (рис. 3).

Всасывание зеленого флюоресцентного белка в тонкой кишке крыс после частичной нефрэктомии. Крысам через 2 месяца после удаления левой почки и 2/3 другой вводили 100 мкл раствора GFP на 150 г массы животного. В этих опытах величина флюоресценции эпителия тонкой кишки через 20 мин после введения составляла 17.4 + 2.2 усл. ед., что достоверно не отличалось от значений флюоресценции у контрольных крыс – 18.7 + 2.3 усл. ед. Флюоресценция в энтероцитах у крыс с частичной нефрэктомией носила диффузный характер.

Накопление зеленого и желтого флюоресцентных белков в проксимальных канальцах почки после их всасывания в желудочно-кишечном тракте крыс. Для выяснения путей метаболизма всосавшихся в кишке белков были исследованы ткани печени и почки. У исследованных животных не обнаружено флюоресценции в клетках печени после введения маркерных белков зондом в желудок или непосредственно в кишку.

После введения наркотизированным животным в кишку или ненаркотизированным животным перорально зондом растворов GFP или YFP наблюдалась специфическая флюоресценция клеток проксимального отдела нефрона у крыс всех исследованных возрастных групп, а также у лягушек (рис. 4). В тоже время свечения не наблюдалось в клетках дистальных канальцев почки. В клетках канальцев мозгового вещества почки крыс специфической флюоресценции GFP и YFP также не обнаружено.

У крысят разного возраста и взрослых крыс наблюдалась сходная динамика накопления флюоресцентных белков в клетках эпителия проксимальных канальцев. Специфическая флюоресценция в эпителии проксимальных канальцев у крыс всех

Рис. 4. Флюоресценция клеток эпителия мозгового и коркового вещества почки после введения 100 мкл раствора GFP на 150 г массы тела в просвет тонкой кишки. Условные обозначения: мв – мозговое вещество, кв – корковое вещество, дк – дистальный каналец, кл – клубочек, пк – проксимальный каналец. Масштабная линейка равна 100 мкм.

возрастных групп была обнаружена через 20 мин после введения маркерных белков, до этого времени (через 10 и 15 мин после введения белков) специфическая флюоресценция не выявлялась. Через 2 ч величина флюоресценции возрастала (рис. 5).

Когда в опытах на взрослых крысах время после введения маркерных белков было увеличено до 5 ч, то было установлено, что флюоресценция продолжала увеличиваться и достигала наибольших значений, составив 74,2 + 8,3 усл. ед. для GFP и 88,3 + 9,6 усл. ед. для YFP. Наименьшие значения пиков интенсивности флюоресценции были зарегистрированы у взрослых крыс (50,4 + 5,9 усл. ед. для

*

Рис. 5. Интенсивность флюоресценции клеток эпителия проксимального канальца почки в зависимости от времени после введения зондом (наружный диаметр не более 1 мм) в желудок GFP у крыс в различные периоды постнатального онтогенеза.

Абсцисса – время после введения GFP (100 мкл на 150 г массы животного), мин. Ордината – интенсивность флюоресценции в условных единицах. Достоверность отличий от взрослых крыс: * – p<0,001.

GFP и 61,7 + 6,4 усл. ед. для YFP), а наибольшие – у 5- дневных крысят (58,1 + 6,5 усл. ед. для GFP и 72,5 + 7,7 усл ед. для YFP). Эти данные достоверно отличаются друг от друга (p<0,001). Таким образом, чем меньше возраст животного, тем интенсивнее происходит накопление флюоресцентных белков в клетках эпителия

проксимальных канальцев нефрона.

Характер распределения маркерных белков в клетках проксимального канальца. Распределение флюоресценции в цитоплазме клеток проксимального канальца нефрона почки было неравномерным. У крыс всех возрастных групп интенсивная флюоресценция была распределена в этих клетках в виде образований округлой формы размером 0,5-2,0 мкм и с характерным зеленым свечением в случае с GFP и желтым после введения YFP (рис. 6). Через 20 мин после введения белка в кишку эти структуры были локализованы преимущественно в апикальной области цитоплазмы, через 2 ч они выявлялись во всей цитоплазме. У взрослых крыс через 2 ч после введения маркерных белков в кишку на полученных имиджах визуализировались единичные флюоресцирующие гранулы. В эпителиальных клетках проксимального канальца 12-дневных крысят количество гранул со специфической флюоресценцией было больше, чем у взрослых и 25-дневных крыс, и они выявлялись по всей площади цитоплазмы, достигая диаметра 1-1,5 мкм. У 5-дневных крыс через 2 ч после введения GFP и YFP в кишку флюоресцирующие гранулы также были распределены по всей цитоплазме. Единичные гранулы достигают размера до 2 мкм, более крупные гранулы, по-видимому, являлись результатом слияния мелких гранул и характеризовались более интенсивным свечением. В экспериментах с введением раствора PBS без флюоресцентных белков специфического свечения в клетках эпителия проксимального канальца нефрона выявлено не было ни в одном из вариантов опытов.

Накопление зеленого флюоресцентного белка в клетках эпителия проксимальных канальцев почки после его всасывания в желудочно-кишечном тракте у лягушек. Динамика накопления GFP у лягушек в проксимальных канальцах почки такая же, как и у крыс. Флюоресценция клеток эпителия проксимального канальца выявляется через 20 мин после введения GFP в желудок, а пик флюоресценции наблюдается через 5 ч (117,6 + 10,3 усл. ед.). Таким образом, скорость увеличения интенсивности свечения GFP в клетках проксимального канальца почки лягушек и крыс различных возрастных групп близка, но интенсивность свечения GFP через 5 ч после его введения у лягушек выше. Характер распределения GFP в клетках эпителия проксимального канальца нефрона был аналогичен распределению этого белка у крыс. Через 5 ч после перорального введения GFP в цитоплазме эпителиальных клеток обнаруживались флюоресцирующие гранулы, размером 1,5-2 мкм (рис. 7А). При введении раствора PBS без GFP наблюдалось лишь слабое фоновое свечение (рис. 7Б).

Рис. 6. Флюоресценция в клетках эпителия проксимального канальца почки через 2 ч введения после введения в просвет тонкой кишки раствора GFP у взрослых крыс (А), 25-дневных крысят (Б), 12-дневных крысят (В), 5-дневных крысят (Г).

Условные обозначения: пк – проксимальный каналец, прк – просвет канальца, я – ядро. Масштабная линейка на всех имиджах равна 10 мкм.

Рис. 7. Флюоресценция в клетках проксимального канальца почки лягушек через 5 ч после введения в желудочно-кишечный тракт раствора GFP (А) или в контрольных экспериментах (Б) in vivo. Условные обозначения – см. рис. 6. Масштабная линейка на всех имиджах равна 10 мкм.

Накопление зеленого флюоресцентного белка в проксимальных канальцах почки после его всасывания в желудочно-кишечном тракте у крыс с частичной нефрэктомией. Накопление GFP в клетках проксимальных канальцев у крыс с частичной нефрэктомией было ниже, чем у контрольных крыс. Характер распределения GFP в клетках эпителия проксимального канальца у крыс с частичной нефрэктомией аналогичен описанному выше распределению этого белка у неоперированных крыс (рис.8).

Накопление флюоресцеина в проксимальных канальцах почки после его всасывания в желудочно-кишечном тракте. После введения 100 мкл флюоресцеина на 150 г массы животного в просвет тонкой кишки взрослых крыс оценивали характер его накопления. Интенсивное свечение обнаруживалось в клетках проксимального канальца, оно характеризовалось диффузным распределением по

*

Рис. 8. Динамика флюоресценции клеток эпителия проксимального канальца почки после введения GFP в желудочно-кишечный тракт крыс с частичной нефрэктомией. Абсцисса – время, мин. Ордината – интенсивность флюоресценции в условных единицах; ▲ – частичная нефрэктомия, ■ – контроль; n=100. Достоверность отличий от крыс с частичной нефрэктомией: * – p<0,001.

Рис. 9. Флюоресценция клеток эпителиального слоя проксимального канальца почки после введения в просвет тонкой кишки флюоресцеина (А) или раствора GFP (Б) у взрослых крыс. Эксперименты in vivo, время после введения флюоресцеина и GFP 2 часа.

Условные обозначения: пк - проксимальный каналец, прк – просвет канальца, я – ядро. Масштабная линейка на всех имиджах равна 10 мкм.

цитоплазме (рис. 9А), в отличие от распределения маркерных белков, после введения которых флюоресценция была представлена в виде образований округлой формы (рис. 9Б).

Заключение

Задача работы заключалась в выяснении судьбы чужеродного белка, всосавшегося в кишке. В настоящее время не разработаны методы изучения всасывания нерасщепленных белков и полипептидов, нет данных для суждения о том, сколь широко распространено это явление в животном мире. Мы исследовали возможность всасывания в тонкой кишке флюоресцентного белка, который обладает флюоресценцией только при сохранении интактной структуры молекулы. Речь идет, в частности, о GFP, у которого только молекулы с сохраненной третичной структурой обладают флюоресценцией (Tsien, 1998). Для решения физиологической задачи – всасывания в кишке и аккумуляции в почке такого белка нами был использован высокочувствительный метод – конфокальная лазерная флюоресцентная микроскопия. Были использованы белки – GFP и YFP.

Была установлена флюоресценция в энтероцитах после введения в просвет кишки GFP и YFP, что свидетельствует о всасывании этих маркерных белков через люминальную мембрану в тонкой кишке. Полученные данные о всасывании флюоресцентных белков у крысят разного возраста согласуются с известными фактами всасывания пищевых белков материнского молока у млекопитающих в раннем онтогенезе (Ogra et al., 1977; Walker, 1986). Полученные результаты свидетельствуют о том, что всасываться в кишечнике млекопитающих могут не только белки, являющиеся обычными компонентами пищи, но и чужеродные белки, такие как GFP и YFP.

Продемонстрирована возможность всасывания флюоресцентных белков в тонкой кишке лягушек в экспериментах in vivo. Динамика всасывания флюоресцентных белков в эпителии тонкого кишечника у лягушек подобна динамике накопления этих белков у двенадцатидневных крысят.

Для решения вопроса о дальнейшей судьбе всосавшихся в кишке белков были исследованы клетки печени и проксимального канальца нефрона. GFP и YFP не были обнаружены в клетках печени после их перорального введения крысам, но было отмечено их накопление в эпителиальных клетках проксимального канальца нефрона. Можно предположить, что всасываемые флюоресцентные белки поступают в портальный кровоток, но не извлекаются клетками печени и с током крови поступают в почки, фильтруются в ее клубочках, затем реабсорбируются клетками проксимального канальца, которые обеспечивают поступление в клетки профильтровавшихся белков для их последующего гидролиза.

Исследование флюоресценции эпителия проксимального канальца нефрона лягушек и крыс после введения маркерных белков в тонкую кишку свидетельствует о том, что аккумуляция белков, прошедших через эпителиальный барьер кишки без гидролиза и поступивших в кровь, происходит в почке как млекопитающих, так и лягушек. Накопление флюоресцентных белков клетками проксимального канальца нефрона у крыс с частичной нефрэктомией ниже, чем у контрольных животных.

Полученные данные дают основания считать, что наряду с классической схемой гидролиза пептидов и белков до аминокислот в кишечнике и их использования для построения эндогенных белков, существует еще один путь метаболизма белков. Начальным этапом этого пути является частичное всасывание белков в тонкой кишке в нерасщепленном виде и поступление чужеродного белка в кровь. Можно полагать, что после всасывания в кишке белок, поступивший в кровь, фильтруется в почечных клубочках и реабсорбируется из канальцевой жидкости клетками проксимальных канальцев нефрона.

Выводы

  1. Разработан метод исследования всасывания флюоресцентных белков в тонкой кишке после введения белков зондом в желудок или непосредственно в тонкую кишку с помощью конфокальной флюоресцентной микроскопии.

  2. У крыс показано всасывание в нерасщепленном виде зеленого или желтого флюоресцентных белков, флюоресценция в энтероцитах распределяется в цитоплазме диффузно, свечение выше в апикальной области цитоплазмы по сравнению с базальной. Зеленый и желтый флюоресцентные белки не абсорбируются клетками толстой кишки и не обнаруживаются в клетках печени.

  3. Динамика всасывания у крыс характеризуется появлением флюоресценции в энтероцитах через 3 мин после введения белков в кишку, флюоресценция нарастает до максимума с последующим снижением через 20-30 мин до фоновых значений.

  4. У крыс скорость всасывания маркерных белков и максимум флюоресценции в энтероцитах снижаются с возрастом животных.

  5. После всасывания в тонкой кишке крыс и лягушек флюоресцентные белки поступают с током крови в почки и накапливаются в эпителиальных клетках проксимального канальца нефрона в виде флюоресцирующих округлых образований диаметром 0.5-2.0 мкм.

  6. У лягушек, как и у крыс, показано всасывание флюоресцентных белков в энтероцитах и их аккумуляция в эпителиальных клетках проксимального канальца почки. Величина и динамика свечения зеленого флюоресцентного белка в энтероцитах у лягушек сходны с таковыми у двенадцатидневных крысят, максимум флюоресценции в эпителиальных клетках проксимального канальца нефрона выше, чем у крыс.

  7. У крыс с развивающейся почечной недостаточностью (через 2 мес после частичной нефрэктомии) снижена аккумуляция зеленого флюоресцентного белка в эпителии проксимального канальца.

  8. Сделано заключение, что зеленый и желтый флюоресцентные белки могут абсорбироваться в энтероцитах без гидролиза, а после их всасывания в кровь реабсорбироваться и аккумулироваться в эпителиальных клетках проксимальных канальцев нефрона, что свидетельствует о важной роли почки в утилизации чужеродных белков. Этот путь поступившего в желудочно-кишечный тракт белка впервые показан у крыс в различные периоды постнатального онтогенеза, крыс с компенсаторной гипертрофией почки, а также у лягушек.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

    1. Статья в реферируемом журнале:

1. Бурмакин М.В., Селивёрстова Е.В., Наточин Ю.В. “Накопление желтого флюоресцентного белка в почке после его всасывания в кишечнике у крыс”. Росс. физиол. журн. им И.М. Сеченова, 2005, т. 91, N. 10, с. 1195-1204.

    1. Тезисы докладов:

1. Бурмакин М.В., Селивёрстова Е.В. “Иммунофлюоресцентный анализ распределения GFP в эпителии тонкого кишечника у крыс”. Вестник молодых ученых. Серия “Физиология и медицина”. Сборник материалов Всероссийской конференции молодых исследователей, 14-16 апреля 2005 года, Санкт-Петербург, “Физиология и медицина”, с.17.

2. Бурмакин М.В., Селивёрстова Е.В., Наточин Ю.В. “Накопление флюоресцентных белков GFP и YFP в почке после их всасывания в тонком кишечнике крыс”. Научные труды I съезда физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005 г.), т. 2, с. 90-91.

3. Бурмакин М.В., Селивёрстова Е.В. “Накопление в почке зеленого и желтого флюоресцентных белков после их всасывания в кишечнике крыс в постнатальном онтогенезе”. XIII международное совещание и VI школа по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006 г.), с.39.



Скачать документ

Похожие документы:

  1. УБИЙЦЫ В БЕЛЫХ ХАЛАТАХ ИЛИ КАК ВРАЧИ ДОБИВАЛИ СТАЛИНА

    Документ
    ... вести следствие но делу арестованного доктора медицинских наук профессора Я.Г. Этингера. На допросах Этингер признался ... Я.Г. Этингер получил звание профессора, а через два года - степень доктора медицинских наук ([126], видимо, без ...
  2. Вестник пермского

    Документ
    ... профессор, докт. психол. наук, Киров), Александр Октябринович Прохоров (профессор, докт. психол. наук ... профессор философского факультета, Университет штата Флорида, США), Дьёрдь Сарвари (доктор ... технологий в медицинскую практику за последние ...
  3. Вестник пермского

    Документ
    ... профессор, докт. психол. наук, Киров), Александр Октябринович Прохоров (профессор, докт. психол. наук ... профессор философского факультета, Университет штата Флорида, США), Дьёрдь Сарвари (доктор ... технологий в медицинскую практику за последние ...
  4. Владимир козлов владимир майков трансперсональный проект психология антропология духовные традиции (1)

    Книга
    ... доктор психологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки России, В.В. Новиков доктор философских наук, профессор К.А. Абульханова-Славская доктор психологических наук, профессор ... научной моделью современной медицинской практики, которая не ...
  5. Владимир козлов владимир майков трансперсональный проект психология антропология духовные традиции (2)

    Книга
    ... доктор психологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки России, В.В. Новиков доктор философских наук, профессор К.А. Абульханова-Славская доктор психологических наук, профессор ... научной моделью современной медицинской практики, которая не ...
  6. Лекции по эзофагогастродуоденоскопии

    Учебное пособие
    ... , докторами медицинских наук Кушниренко О.Ю. и Под- шиваловым В.Ю. Зав. кафедрой профессор Совцов С.А., ректор академии профессор Фокин ... кафедре хирургии с курсом эндоскопии УГМАДО докторами ме­дицинских наук О.Ю. Кушниренко и В.Ю. Подшиваловым и ...

Другие похожие документы..