textarchive.ru

Главная > Книга


тов лизосом) - необычная термостабильность β-галактозидазы.

Часто разница между нормальным и дефектным ферментом выявляется на уровне белков, например по изменению электрофоретической подвижности. В таких случаях у измененного белка потеря или снижение каталитических свойств далеко не всегда сопровождаются изменением его иммунологических характеристик, т. е. белок сохраняет способность связываться с антителами против нормального фермента. Впервые такой перекрестно-реагирующий материал (ПРМ, англ. CRM) описан у бактерий (триптофансинтаза у Е. coli). Подобные перекрестно-реагирующие белки часто обнаруживают при наследственных нарушениях ферментов у человека (табл. 4.2): они играют важную роль в выявлении гетерозигот - носителей гемофилии А (разд. 4.2.2.8).

У человека в отличие от бактерий чаще встречаются качественные изменения фермента, чем случаи полной или почти полной его утраты. Это означает, что большинство известных в настоящее время ферментативных дефектов у человека вызвано мутациями в структурных генах, а не в регуляторных участках, как у бактерий. Эти факты весьма важны для понимания принципов регуляции генов высших организмов, в том числе и у человека (разд. 4.7).

Приведенный ниже метод имеет особое значение для анализа повреждений ферментных систем.

Изучение ферментативных нарушений в культуре фибробластов человека. В 1940-1950 гг., когда удалось получить ответы на ключевые вопросы генетики бактерий, многим ученым казалось, что изучение индивидуальных клеток высших организмов позволит увеличить разрешающую способность генетического анализа эукариот на несколько порядков [162]. Условия культивирования клеточных линий были разработаны несколькими годами раньше. Однако все линии клеток, способные размножаться в культуре неопределенно долгое время, либо получены из злокачественных опухолей, как одна из наиболее распространенных линий – HeLa, либо при культивировании утрачивают способность к контактному торможению, т.е. «трансформируются». Генетически такие клетки отличаются от нормальных: они почти всегда анеуплоидны, причем число хромосом в наборе колеблется внутри одной клеточной линии и даже внутри конкретной культуры. Трансформированные клетки непригодны для генетического анализа, необходимо разработать методы, позволяющие культивировать нормальные, эуплоидные клетки.

Количественные биохимические эксперименты, например измерение активности ферментов, имеют смысл, только если рост клеток можно тщательно контролировать. Полезно рассмотреть принципы этих методов, поскольку они применимы и для анализа клеток из амниотической жидкости.

Возможные трудности. Метод культивирования фибробластов сопряжен с рядом трудностей. Эти клетки плохо растут или вовсе не растут на химически определенных средах. Приходится добавлять сыворотку, содержащую полный набор необходимых питательных веществ. Как правило, для этого используют эмбриональную сыворотку теленка. К сожалению, очень трудно раз и навсегда стандартизировать условия культивирования: необходимо постоянно контролировать и уточнять такие параметры, как рН, содержание глюкозы и др.

Фибробласты нельзя культивировать в жид-

4. Действие генов 15

кой среде, они растут только в виде монослоя клеток, прикрепленных к твердой поверхности. Вот почему отбирать пробы, как это делается при работе с суспензионными культурами, в данном случае нельзя. Приходится вести параллельно много культур небольшого объема. Это приводит к дополнительным вариациям, которые с трудом поддаются контролю. Следует помнить также, что для фибробластов в отличие от стабилизированных опухолевых линий число клеточных делений ограниченно и, следовательно, ограниченны возможности наращивания биомассы.

Рост фибробластов в культуре. Материал, полученный при биопсии кожи и предназначенный для хромосомного анализа, измельчают, помещают в чашки Петри с питательной средой. Чашки содержат в инкубаторе с 5%-ным СО2. Это позволяет поддерживать постоянный рН. Приблизительно через 15 дней фибробласты начинают расти на поверхности среды и в конечном итоге формируют монослой. Клетки отделяют от поверхности обработкой трипсином и после центрифугирования переносят в свежую среду.

Развитие культуры происходит циклично. Цикл состоит из начальной лаг-фазы, за которой следует фаза логарифмического роста, продолжающаяся до тех пор, пока количество клеток в культуре не достигает стационарного значения («лаг-лог стационарный цикл»). В течение цикла активность ферментов и внутриклеточная концентрация метаболитов меняются. Поэтому сравнивать биохимические характеристики можно только с учетом изменений этих параметров на протяжении всех стадий цикла.

Итак, использование фибробластов человека в энзимологических экспериментах требует огромной и кропотливой технической работы [1208]. Затраченный труд, однако, как правило вознаграждается. Именно в культуре фибробластов у больного галактоземией удалось показать нарушение функций галактозо-1-фосфат—уридилтрансферазы [1177]. Благодаря этому методу были обнаружены многие нарушения функций ферментов. Он лежит и в основе пренатальной диагностики, которая в настоящее, время с успехом используется для изучения генетически обусловленных повреждений ферментов.

Однако не все повреждения ферментов проявляются в фибробластах. В таких случаях можно использовать для анализа линии других клеток, например линии лимфоцитов или эритроцитов. Заметим, что, как правило, повреждения ферментов, не поддающиеся исследованию в фибробластах, нельзя изучать и в культуре клеток из амниотической жидкости.

4.2.2.2. Типичные нарушения функций ферментов: ферменты эритроцитов

К настоящему времени подробно изучена группа наследственных заболеваний, связанных с недостаточностью ферментативных систем эритроцитов [933, 1345]. Эритроциты человека – безъядерные клетки, неспособные синтезировать мРНК. Синтез белка происходит в клетках-предшественниках, еще содержащих ядро. В результате в зрелых эритроцитах имеется набор ферментативных систем, которые могут активно функционировать лишь некоторое время. «Отмирание» клеток сопровождается постепенной потерей активности ферментов и происходит после циркуляции в кровотоке в течение 120 суток. Описан ряд синдромов, обусловленных наследственными повреждениями ферментативных систем эритроцитов. Один из них-несфероцитарная гемолитическая анемия.

Генетически обусловленные повреждения ферментов гликолиза. Один из наиболее важных путей катаболизма в зрелых эритроцитах, необходимый для образования богатых энергией фосфатов (АТР),анаэробный гликолиз, или путь Эмбдена—Мейергофа (рис. 4.3). Эта цепь анаэробных реакций приводит к образованию на один моль глюкозы двух молей молочной кислоты и четырех молей АТР, из которых один затрачивается в ходе гликолиза на фосфорилирование глюкозо-6-фосфата и превращение его в фруктозо-1,6-дифосфат и еще один – на превращение глюкозы в глюкозо-6-фосфат. Итого, в полной цепи реакций на моль глюкозы образуется 2 моля АТР, необходимого для разнообразных клеточных функций эритроцитов, таких как поддержание формы (эритроциты представляют собой двояковогнутый диск), работы катионного насоса, а также синтеза разных метаболитов, например глутатиона (GSH) или AMP. Гликолиз катализируется 13 ферментами. Приблизительно 5-10% глюкозо-6-фосфата окисляется на пути так называемого гексозомонофосфатного шунта: в результате последовательности реакций пентозофосфат превращается в фруктозофосфат или глицеральдегид-3-фосфат, которые

16 4. Действие генов

Рис. 4.3. Гликолиз в эритроцитах. В процессе участвует 11 ферментов. Общая скорость реакции лимитируется гексокиназой, которая катализирует превращение глюкозы в глюкозо-6-фосфат. Из него в результате цепи превращений образуется 1,3-дифосфоглицерат. Дифосфоглицерат может либо непосредственно расщепляться с образованием 3-фосфоглицерата и АТР (реакция осуществляется фосфогляцерокиназой), либо через 2,3-дифосфоглицерат превращаться в неорганический фосфат и 3-фосфоглицерат, который затем вновь поступает в систему реакций гликолиза (цикл Рапопорта-Люберинга). В цикле Рапопорта-Люберинга АТР не образуется. Следовательно, расщепление глюкозы может приводить к разному выходу АТР. Однако поддержание постоянной концентрации 2,3-дифосфоглицерата в эритроцитах необходимо для нормальной диссоциации оксигемоглобина. Другое условие нормального функционирования гемоглобина – достаточная концентрация свободного NADH, образующегося в реакции, катализируемой глицеральдегид-фосфатдегидрогеназой. NADH необходим как для превращения пирувата в лактат, так и для восстановления метгемоглобина. Около 5-10% глюкозо-6-фосфата расщепляется в реакциях гексозомонофосфатного шунта. В результате ряда последовательных превращений из пентозофосфата образуется фруктозофосфат или глицеральдегид-3-фосфат, который снова используется в цепи реакций гликолиза. Гексозомонофосфатный цикл в эритроцитах – источник NADH, необходимого для восстановления окисленного глутатиона. Эта реакция осуществляется глутатионредуктазой. Гликолиз контролируется сложной «многоступенчатой» системой, в которой ключевую роль играют гексокиназа, фосфофруктокиназа и концентрация неорганического фосфата и ионов магния. На рисунке показаны также изученные у человека этапы блокирования метаболизма. Нумерация этапов блокирования соответствует нумерации в таблице 4.3, блоки этапов 6 (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) и 10 (енолаза) не внесены в таблицу 4.3, поскольку нет прямых доказательств связи между блокированием метаболизма и недостаточностью этих ферментов. (На этом и других рисунках буквой Ф обозначены фосфатные группы химических соединений.)

4 Действие генов 17

снова утилизируются в цепи реакций гликолиза. Гексозомонофосфатный шунт – важный источник NADPH, необходимого для восстановления окисленного глутатиона. Эта реакция катализируется глутатионредуктазой.

Несфероцитарные гемолитические анемии. В 1953 г. Даше с соавторами описали группу заболеваний, родственных гемолитической анемии, которые назвали несфероцитарными в отличие от наследственного сфероцитоза [1049]. Больные страдали повышенным гемолизом, сопровождавшимся желтухой разной степени тяжести, небольшим увеличением селезенки и образованием камней в желчном пузыре. Эти признаки отличали описанное ими заболевание от наследственного сфероцитоза (18290). Устойчивость эритроцитов к осмотическому давлению у больных несфероцитарной анемией оказалась нормальной, не было обнаружено и структурных изменений гемоглобина. С помощью тонких методов гематологического анализа установлено, что заболевание гетерогенно по своей природе, хотя наблюдается заметное перекрывание параметров для различных форм болезни. Для детального изучения этой группы нарушений необходимо дальнейшее развитие методов энзимологии.

Повреждения ферментов гликолиза. В период между 1961-1975 гг. были описаны генетически обусловленные нарушения 11 из 13 ферментов гликолиза. По меньшей мере для 8 из описанных дефектов удалось показать связь с несфероцитарной гемолитической анемией. В ряде случаев наблюдали сопутствующие нарушения центральной нервной системы и мышц. В общем случае уменьшение активности фермента ниже критического значения приводит к накоплению метаболита, предшествующего данному блоку, и к падению концентрации метаболита, образующегося в данной реакции. Недостаточность некоторых из этих ферментов сопровождается побочными эффектами, например снижением уровня АТР. Однако системе присуща способность к регуляции, которая увеличивает ее стабильность, поэтому на основании данных только клинического и гематологического анализа нельзя судить о природе и степени повреждения фермента. Кроме того, обычно подобный анализ проводят на популяции в основном молодых эритроцитов, в которых активность ферментов, как правило, выше, чем в старых клетках, и поэтому недостаточность по отдельным ферментам может остаться незамеченной.

Некоторые ферментативные нарушения описаны в таблице 4.3. Нумерация использована та же, что и на рисунке 4.3. Приведенные примеры позволяют сформулировать ряд замечаний более общего характера, касающихся дефектов ферментативных систем человека.

Доступность материала для исследования ферментов гликолиза. В настоящее время наследственные повреждения известны почти для всех ферментов гликолиза. Этим гликолиз выделяется среди прочих путей метаболизма, для которых далеко не всегда известно, существуют ли наследуемые дефекты, затрагивающие хотя бы некоторые из ферментов. Проще всего можно объяснить этот факт тем, что необходимую для исследований кровь больных сравнительно легко получить: анализ венозной крови больных, находящихся в стационаре, вполне доступен в отличие, например, от соскоба кожи, не говоря уже о биопсии мозга. Кроме того, эритроциты - это высокоспециализированные клетки, поэтому в них функционируют далеко не все ферментативные системы, имеющиеся в других клетках. Таким образом, количество реакций, которые могут быть нарушены, относительно невелико. Это значительно облегчает анализ.

Перечисленные преимущества клеток крови как объекта исследований широко использовались, например, при изучении глюкозо-6-фосфат—дегидрогеназы и особенно в исследованиях гемоглобина. В результате этих работ сложились основополагающие представления о взаимоотношениях генов и белков, которые они кодируют (разд. 4.3), а также о естественном отборе в человеческих популяциях (разд. 6.2.1.6).

18 4. Действие генов

Таблица 4.3. Случаи несфероцитарной гемолитической анемии (НСГА), обусловленные недостаточностью различных ферментов гликолиза (нумерация та же, что и на рис. 4.4)

Дефектный фермент

Активность фермента у больного

Гематологические симптомы

Симптомы, проявляющиеся в других системах органов, в особенности в центральной нервной системе

Тип наследования

Примечания

1

Гексокиназа

30-60%

НСГА,

часто в тяжелой форме

(У одного больного наблюдались скелетные аномалии)

Аутосомнорецессивный

В некоторых случаях изменены только эритроциты, в других - эритроциты и лейкоциты

2

Глюкозофосфатизомереза (GPI)

15-25%

НСГА, часто в тяжелой форме, иногда желтуха новорожденных

Других симптомов нет

-»-

Уменьшена термостабильность фермента. Обнаружен ряд форм фермента, отличающихся от нормального по электрофоретической подвижности. Активность фермента снижена во всех тканях (т.е. тканеспецифичного фермента не существует)

3

Фосфофруктокиназа (PFK)

8-80%

Легкая форма НСГА

В некоторых семьях встречается тяжелая миопатия и миоглобинемия; в некоторых случаях гликогеноз (без НСГА), тип VII

-»-

Органоспецифические ферменты; возможно даже в эритроцитах имеются два фермента; клиническая и биохимическая гетерогенность

4

Альдолаза

НСГА

—»—

Известно лишь несколько случаев

5

Триозофосфатизомераза (TPI)

≈ 10%

НСГА

Нейромышечные аномалии, слабоумие, ранняя смертность, желтуха новорожденных

—»—

Нарушения активности ферментов проявляются также в лейкоцитах, скелетных мышцах и сыворотке крови. Связь мышечных симптомов с дефектом TPI точно не установлена

7

Фосфоглицерокиназа (PGK)

5-30%

Тяжелая НСГА

Иногда наблюдается олигофрения, атаксия и афазия

Х-сцепленное наследование

В некоторых случаях активность PGK снижается в лейкоцитах

9

Дифосфоглицеромутаза/ фосфатаза

~3%

НСГА средней тяжести

Другие симптомы отсутствуют

Аутосомнорецессивный

11

Пируваткиназа (РК)

5-20%

Сильно различаются (от тяжелой НСГА до нормы)

Симптомы, общие для различных случаев, отсутствуют

—»—

Вариабельность свойств фермента

В таблице отсутствуют некоторые ферменты гликолиза (№ 6, 8, 10), для которых связь с НСГА точно не показана. Подробнее об этих ферментативных дефектах см. [1148].

4. Действие генов 19

Энзимологические исследования позволяют выявить генетическую неоднородность. В разд. 3.3 уже говорилось о том, что все попытки выявить генетическую неоднородность популяции на основе изучения фенотипа наталкиваются на непреодолимые препятствия. Если два фенотипа очень сильно перекрываются и характеризуются аутосомно-рецессивным типом наследования, то единственным доказательством их генетической неоднородности может быть рождение у пары гомозиготных родителей только здоровых детей (разд. 3.1.3). Но, если проведен энзимологический анализ, генетическая неоднородность может быть однозначно установлена по следующим признакам.

1. Все наследуемые дефекты ферментов гликолиза в эритроцитах, приведенные в табл. 4.3 и на рис. 4.3, вызывают практически неразличимые по клиническим проявлениям варианты гемолитической анемии. Один из источников генетической неоднородности - сходство или даже совпадение фенотипических проявлений мутаций в генах, кодирующих разные ферменты данного пути метаболизма. Тот же вывод можно сделать, анализируя информацию, полученную при сравнении изученных случаев болезни накопления гликогена.

2. Второй источник неоднородности – разнообразие изменений одного и того же конкретного фермента, вызываемых различными мутациями в его гене. Чем больше методов используют для анализа, тем больше удается обнаружить различий. Вероятность генетической гетерогенности очень велика, поскольку очень велико число мутаций, вызывающих аминокислотные замены.

При большинстве наследуемых дефектов ферментных систем у гомозигот сохраняется остаточная активность фермента. Во втором столбце табл. 4.3 представлены значения активности ферментов гликолиза в эритроцитах больных, гомозиготных по наследственным дефектам гликолиза. Во всех случаях, когда удавалось провести измерения, наблюдалась остаточная активность, иногда довольно значительная. В некоторых случаях причиной этого могла быть и активность другого фермента, способного катализировать ту же реакцию. Однако, как правило, повреждения фермента в результате отдельной мутации не столь значительны, чтобы полностью его инактивировать. По мнению Киркмана [1866], такая остаточная активность характерна для большинства наследственных повреждений ферментов у человека. Между тем в клетках бактерий мутации, как правило, вызывают полный блок того или иного пути метаболизма. Это обстоятельство можно объяснить отчасти тем, что в человеческой популяции происходит жесткий отбор на жизнеспособность: полный блок ключевых реакций метаболизма с большой вероятностью оказывается летальным. С другой стороны, у бактерий мутации удается обнаружить главным образом в тех случаях, когда активность того или иного фермента утрачена практически полностью. Мутанты с неполным блоком (leaky) нередко выживают даже на минимальной среде. Существует принципиальная разница между характером проявления мутаций у бактерий и человека. Мутантные штаммы бактерий наиболее часто обнаруживают по утрате способности расти на среде, стандартной для конкретной культуры, в то время как большинство мутаций, затрагивающих ферменты человека, обнаружены у больных наследственными заболеваниями. С появлением методов, позволяющих изучать все типы мутаций у бактерий, у них был идентифицирован полный набор мутаций, сходных со структурными мутациями, затрагивающими ферментные системы человека.

Клинические проявления наследственного дефекта фермента тесно связаны с нормальной активностью фермента в различных тканях. В одном организме и даже в отдельной клетке может существовать несколько форм данного фермента [120]. Это так называемые изоферменты. Их существование можно объяснить как негенетическими причинами (вторичные изменения фермента в тканях), так и генетическими (наличием разных генетических локусов, кодирующих полипептиды с более или ме-



Скачать документ

Похожие документы:

  1. БИБЛИОГРАФИЯ = Фогель Ф Мотульски А Генетика человека В 3-х т Т 3 Пер с англ – М Мир 1990 – 366 с Фогель Ф Мотульски А Генетика человека В 3-х т Т 3 Пер с англ – М Мир 1990 – 366 с

    Книга
    ... 294 336 378 420 ... Мира, 93. ЭЛЕКТРОННОЕ ОГЛАВЛЕНИЕ БИБЛИОГРАФИЯ = Фогель Ф., Мотульски А. Генетикачеловека: В 3-х т. Т. 3: Пер. с англ. – М.: Мир, 1990. – 366 с. 1 Фогель Ф., Мотульски А. Генетикачеловека: В 3-х т. Т. 3: Пер. с англ. – М.: Мир, 1990 ...
  2. «ОПАСНОЕ ЗНАНИЕ» В «ОБЩЕСТВЕ РИСКА» (век генетики и биотехнологии)

    Документ
    ... Альтерпрес,2002. 284 с. Фогель Ф., Мотульски А. Генетикачеловека: В 3-х М.: Мир, 1990. –378 с. Форрестер Дж. Мировая динамика Пер. с англ. Под ред. Д.М.Гвишиани ... будущего: роль этики 373 КРАТКАЯ БИБЛИОГРАФИЯ 389 1 Кальниш В.В., Ена А.И. ...
  3. Проект ingsat

    Документ
    ... Генетикачеловека. В 3-х т. Т. 1. Пер. с англ. М., Мир, 1989. 312 с.djvu Фогель Ф., Мотульски А. Генетикачеловека. В 3-х т. Т. 2. Пер. с англ. М., Мир, 1990. 378 с.djvu Фогель Ф., Мотульски А. Генетикачеловека. В 3-х т. Т. 3. Пер. с англ. М., Мир ...

Другие похожие документы..