textarchive.ru

Главная > Книга


4.2. Гены и ферменты

4.2.1. Гипотеза «один ген – один фермент»

Первые исследования. После того как в 1902 г. Гэррод указал на связь генетического дефекта при алкаптонурии с неспособностью организма расщеплять гомогентизиновую кислоту, важно было выяснить специфический механизм, лежащий в основе этого нарушения. Поскольку тогда уже было известно, что метаболические реакции катализируются ферментами, можно было предположить, что именно нарушение какого-то фермента приводит к алкаптонурии. Такая гипотеза обсуждалась Дришем (в 1896 г.). Ее высказывали также Холдейн (1920 г., см. [1117]) и Гэррод (1923 г. [1091]). Важными этапами в развитии биохимической генетики стали работы Кюхна и Бутенандта [1178; 1027] по изучению окраски глаз у мельничной огневки Ephestiakuhniellaи аналогичные исследования Бидла и Эфрусси на Drosophila(1936) [987]. В этих пионерских работах для выяснения механизмов действия генов были выбраны мутанты насекомых, изученные ранее генетическими методами. Однако такой подход не привел к успеху. Проблема оказалась слишком сложной, и чтобы решить ее, необходимо было:

1) подобрать простой модельный организм, удобный для экспериментального изучения;

2) искать генетическую основу биохимических признаков, а не биохимическую основу генетически детерминированных признаков. Оба условия были выполнены в работе Бидла и Татума в 1941 году [988] (см. также Бидл, 1945 [986]).

Модель Бидла и Татума. Статья этих исследователей начиналась так:

«С точки зрения физиологической генетики - развитие и функционирование организма может быть сведено к сложной системе химических реакций, которые каким-то образом контролируются генами. Вполне логично предположить, что эти гены... либо сами выступают в роли ферментов, либо определяют их специфичность. Известно, что генетики-физиологи обычно пытаются исследовать физиологические и биохимические основы уже известных наследственных признаков. Этот подход позволил установить, что многие биохимические реакции контролируются специфическими генами. Такие исследования показали, что ферменты и гены обладают специфичностью одного порядка. Однако возможности этого подхода ограниченны. Наиболее серьезное ограничение заключается в том, что при этом в поле зрения исследователей попадают наследственные признаки, не имеющие летального эффекта и, следовательно, связанные с реакциями, которые не очень существенны для жизнедеятельности организма. Второе затруднение ... заключается в том, что традиционный подход к проблеме подразумевает использование внешне проявляющихся признаков. Многие из них представляют собой морфологические вариации, основанные на системах биохимических реакций, настолько сложных, что их анализ необычайно затруднен.

Подобные соображения привели нас к следующему выводу. Изучение общей проблемы генетического контроля биохимических реакций, определяющих развитие и метаболизм, должно проводиться с помощью процедуры, противоположной общепринятой: вместо того чтобы пытаться выяснить химические основы известных наследственных признаков, необходимо установить, обеспечивают ли гены контроль известных биохимических реакций и как они это делают. Нейроспора, относящаяся к аскомицетам, обладает свойствами, позволяющими реализовать такой подход и одновременно служит удобным объектом для генетических исследований. Вот почему наша программа была построена на использовании именно этого организма. Мы исходили из того, что облучение рентгеном вызывает мутации в генах, контролирующих определенные химические реакции. Пусть для выживания в данной среде организм должен осуществлять какую-то химическую реакцию, тогда мутант, лишенный такой способности, в этих условиях окажется нежизнеспособным. Однако его можно поддерживать и изучать, если выращивать в среде, к которой добавлен жизненно необходимый продукт генетически блокированной реакции».

4 Действие генов 9

Рис. 4.1. Схема эксперимента по обнаружению биохимических мутантов нейроспоры На полноценной среде мутации, индуцированные рентгеновскими лучами или ультрафиолетом, не нарушают роста гриба. Однако на минимальной среде мутант не растет. При добавлении к минимальной среде витаминов способность к росту восстанавливается При внесении аминокислот роста нет На основании этих данных можно предположить, что мутация произошла в гене, который контролирует метаболизм витамина Следующий шаг заключается в идентификации витамина, способного восстановить нормальную функцию Генетический блок обнаружен среди реакций биосинтеза витамина [1303].

Далее Бидл и Татум приводят описание схемы эксперимента (рис. 4.1). В состав полной среды входил агар, неорганические соли, солодовый экстракт, дрожжевой экстракт и глюкоза. Минимальная среда содержала только агар, соли, биотин и источник углерода. Наиболее подробно были исследованы мутанты, которые росли на полной среде и не росли на минимальной. Чтобы установить соединение, синтез которого нарушен у каждого из мутантов, в минимальный агар вносили отдельные компоненты полной среды.

Таким способом были выделены штаммы, неспособные синтезировать определенные факторы роста: пиридоксин, тиамин и парааминобензойную кислоту. Было показано, что эти дефекты обусловлены мутациями в специфических локусах. Работа положила начало многочисленным исследованиям на нейроспоре, бактериях и дрожжах, в которых было установлено соответствие «генетических блоков», ответственных за отдельные метаболические этапы, и специфических нарушений ферментов. Этот подход очень быстро превратился в инструмент, позволяющий исследователям раскрывать метаболические пути.

Гипотеза «один ген - один фермент» получила прочное экспериментальное подтверждение. Как показали работы последующих десятилетий, она оказалась удивительно плодотворной. Анализ дефектных ферментов и их нормальных вариантов позволил вскоре выявить такой класс генетических нарушений, которые приводили к изменению функции фермента, хотя сам белок по-прежнему обнаруживался и сохранял иммунологические свойства. В других случаях менялся температурный оптимум активности фермента. Некоторые варианты можно было объяснить мутацией, влияющей на общий регуляторный механизм и изменяющей в результате активность целой группы ферментов. Подобные исследования привели к созданию концепции регуляции активности генов у бактерий, которая включала и концепцию оперона.

10 4. Действие генов

Первые примеры ферментативных нарушений у человека. Первым наследственным заболеванием человека, для которого удалось показать ферментативное нарушение, была метгемоглобинемия с рецессивным типом наследования (Гибсон и Харрисон, 1947 [1100]; Гибсон, 1948 [1099]) (25080). В этом случае поврежденным ферментом является NADH - зависимая метгемоглобин-редуктаза. Первая попытка систематического изучения группы заболеваний человека, связанных с дефектами метаболизма, была предпринята в 1951 году. При исследовании болезни накопления гликогена [1044] супруги Кори показали, что в восьми из десяти случаев патологического состояния, которое диагностировалось как болезнь Гирке (23220), структура гликогена печени представляла собой нормальный вариант, а в двух случаях была явно нарушена. Было также очевидно, что гликоген печени, накапливаясь в избытке, не может быть непосредственно превращен в сахар, поскольку у больных проявляется тенденция к гипогликемии. Для расщепления гликогена с образованием глюкозы в печени необходимы многие ферменты. Два из них-амило-1,6-глюкозидаза и глюкозо6-фосфатаза-были выбраны для изучения как возможные дефектные элементы ферментной системы. В гомогенатах печени при различных значениях рН было измерено освобождение фосфата из глюкозо-6фосфата. Результаты представлены на рис. 4.2. В нормальной печени обнаруживалась высокая активность с оптимумом при рН 6-7. Сильное нарушение функции печени при циррозе коррелировало с незначительным уменьшением активности. С другой стороны, в случае болезни Гирке с летальным исходом, активность фермента обнаружить вообще не удалось; такой же результат был получен при обследовании второго подобного больного. У двух пациентов с менее выраженными симптомами наблюдалось значительное уменьшение активности.

Было сделано заключение, что в указанных случаях болезни Гирке с летальным исходом имел место дефект глюкозо-6-фосфатазы. Однако в большинстве более легких случаев активность этого фермента оказалась не ниже, чем при циррозе печени, и только у двух больных она была несколько меньшей (рис. 4.2).

По мнению супругов Кори, аномальное накопление гликогена в мышечной ткани нельзя связывать с недостатком глюкозо-6-фосфатазы, поскольку в мышцах этот фермент отсутствует и в норме. В качестве возможного объяснения гликогеноза мышц они предположили нарушение активности амило-1,6-глюкозидазы. Это предсказание вскоре подтвердилось: Форбс [1081] обнаружил такой дефект при одном из клинически выраженных случаев болезни накопления гликогена с вовлечением сердечной и скелетных мышц. Сейчас нам

Рис. 4.2. Освобождение фосфата из глюкозо-6-фосфата в гомогенатах печени различных больных служит мерой активности глюкозо-6-фосфатазы. 1. Значительное освобождение фосфата у больного с нормальной функцией печени. 2. Умеренное снижение при циррозе печени. 3, 4. Значительное снижение у двух пациентов с легкой формой болезни накопления гликогена. 5. Полное отсутствие ферментативной активности у пациента с тяжелой формой болезни Гирке [1044].

4. Действие генов 11

известно большое число ферментативных дефектов при болезни накопления гликогена [1133, 1244].

Хотя по степени проявления различные формы этого заболевания несколько различаются, в клиническом отношении между ними много общего. За одним исключением, все они наследуются по аутосомнорецессивному типу. Если бы ферментативные дефекты не были раскрыты, патология накопления гликогена рассматривалась бы как одно заболевание с характерными внутрисемейными корреляциями по тяжести течения, деталям симптоматики и срокам летального исхода. Таким образом, перед нами пример, когда генетическая гетерогенность, которую можно было лишь предполагать на основании изучения фенотипа (разд. 3.3.5), подтвердилась при анализе на биохимическом уровне: исследование ферментативной активности позволило идентифицировать специфические гены.

В последующие годы темп исследований в области ферментативных дефектов нарастал, и для 588 идентифицированных рецессивных аутосомных генов, которые Мак-Кьюсик описывает в шестом издании своей книги «Менделевское наследование у человека» (1983) [133], более чем в 170 случаях обнаружены специфические ферментативные нарушения. Наши успехи в этой области непосредственно связаны с развитием концепций и методов молекулярной генетики.

Некоторые этапы изучения ферментативных нарушений у человека. Мы приводим лишь наиболее важные вехи этого продолжающегося процесса: 1934 Фёллинг открыл фенилкетонурию

[1080]

1941 Бидл и Татум сформулировали гипотезу «один ген - один фермент» [988] 1948 Гибсон описал первый случай ферментативного нарушения при заболевании у человека (рецессивная метгемоглобинемия) [1099]

1952 Супруги Кори обнаружили недостаточность глюкозо-6-фосфатазы при болезни Гирке [1044]

1953 Джервис продемонстрировал отсутствие фенилаланингидроксилазы при фенилкетонурии [1144]. Бикель сообщил о первой попытке смягчить ферментативное нарушение, применив диету с низким содержанием фенилаланина [1004]

1955 Смитис разработал методику электрофореза в крахмальном геле [1307, 1308]

1956 Карсон и др. обнаружили дефект глюкозо-6-фосфат— дегидрогеназы (G6PD) в случае индуцированной гемолитической анемии [1030]

1957 Калькар и др. описали ферментативную недостаточность при галактоземии, показав, что у человека и бактерий наблюдается идентичное нарушение ферментативной активности [1150]

1961 Крут и Вайнберг продемонстрировали дефект фермента при галактоземии in vitro в культуре фибробластов [1177]

1967 Сигмиллер и др. обнаружили дефект гипоксантин-гуанин—фосфорибозилтрансферазы (HPRT) при синдроме Леша —Найхана [1295]

1968 Кливер описал нарушение эксцизионной репарации при пигментной ксеродерме [1035]

1970 Нейфельд выявил ферментативные дефекты при мукополисахаридозах, что позволило идентифицировать пути расщепления мукополисахаридов [1240]

1974 Браун и Голдстейн доказали, что генетически детерминированная суперпродукция гидроксиметилглютарилСоА-редуктазы при семейной гиперхолестеринемии обусловлена дефектом локализованного в мембране рецептора липопротеинов низкой плотности, который модулирует активность этого фермента (HMG) [1023]

1977 Слай и др. продемонстрировали, что маннозо-6-фосфат (как компонент лизосомальных ферментов) узнается рецепторами фибробластов. Генетический дефект процессинга препятствует связыванию лизосомных ферментов, в результате нарушается их выход в цитоплазму и последующая секреция в плазму (I-клеточная болезнь)

12 4. Действие генов

1980 При псевдогипопаратиреозе обнаружен дефект белка, обеспечивающего сопряжение рецептора и циклазы.

4.2.2. Гены и ферменты у человека: современный уровень знаний

Круг рассматриваемых вопросов. В каждом случае ферментативного дефекта необходим особый подход в методологии исследований и интерпретации результатов. Ограниченный объем настоящего обзора заставляет нас обсуждать эти проблемы кратко и весьма избирательно. Основное внимание будет уделено вопросам 1) важным для понимания общих принципов генетической детерминации и генетического контроля у человека; 2) важным для диагностики ферментативных дефектов и для понимания связи нарушения с этиологией заболевания. Читателям, желающим ознакомиться с группами заболеваний, не рассмотренными в этой главе, мы рекомендуем обратиться к специальным монографиям [203; 182].

4.2.2.1. Обнаружение и анализ ферментативных нарушений

Различия в подходах к исследованию человека и нейроспоры. Успехи в изучении ферментативных нарушений у бактерий и нейроспоры были достигнуты благодаря новому направлению исследований. Авторы при этом не пытались выявить биохимическую природу уже известных мутаций, они индуцировали новые мутации и отбирали среди них те, которые затрагивали известные биохимические реакции. Такой подход дает возможность обнаружить лишь те мутации, которые действительно приводят к появлению дефектов ферментативных систем независимо от того, какую долю в общем числе мутаций они составляют.

В генетических исследованиях человека невозможно ни индуцировать новые мутации, ни выявлять их с помощью системы отбора ауксотрофов, разработанной для нейроспоры. Поэтому изучение нарушений известных путей метаболизма совершенно бесперспективно. Приходится, отталкиваясь от изменений фенотипа, пытаться исследовать лежащие в их основе повреждения ферментных систем. Очевидный недостаток такого подхода заключается в том, что вероятность обнаружить больного с редким заболеванием сравнительно мала. Однако нет худа без добра. Ни одно экспериментальное животное так часто не подвергается медицинскому обследованию, как человек, причем разнообразие методов диагностики огромно: от изучения клинических проявлений, до анализа ферментов. В результате удается наблюдать широкий спектр разнообразных фенотипов. Клинические симптомы, позволяющие распознавать повреждения ферментов. Как обнаружить ферментативные нарушения? Самый простой пример - отсутствие глюкозо-6-фосфатазы при болезни Гирке. Заболевание известно уже давно, клинические проявления позволяют предполагать нарушение специфического метаболического пути. Когда эти реакции будут достаточно изучены и разработаны методы определения активности ферментов, исследователи подойдут вплотную к задаче выявления больных, у которых какой-то один из ограниченного круга ферментов, катализирующих эти реакции, является дефектным. Однако на этом пути возможны затруднения технического характера. Часто мутации обусловливают снижение сродства к субстрату. Однако в большинстве экспериментов in vitro используются настолько высокие концентрации субстрата, что даже измененный мутацией фермент обладает активностью, близкой к норме [1166]. Таким образом, эксперименты in vitro не всегда адекватно отражают активность фермента in vivo. Иногда клинические проявления могут направлять исследователей по ложному пути. Например, при болезни Помпе (гликогеноз II типа) все ферменты основного пути расщепления гликогена совершенно нормальны. Несмотря на это, гликоген накапливается в большинстве тканей, в особенности в сердечной мышце. Выяснилось, что в этом случае изменена а-1,4-глюкозидаза, которая в норме, как и другие гидролазы, находится в лизосомах (разд. 4.2.2.3) и участие которой в метаболизме гликогена не было до сих пор показано<

В других случаях симптомы настолько

4. Действие генов 13

неопределенны, что трудно предположить, какими именно нарушениями метаболизма они вызваны. Так, например, задержки развития у детей могут быть связаны с самыми разнообразными врожденными дефектами метаболизма, возникающими из-за генетически обусловленных повреждений ферментов.

Среди умственно отсталых детей, которые содержатся в больницах, около 1% страдают фенилкетонурией. Впервые это патологическое состояние было обнаружено Фёллингом в 1934 г. при исследовании двух сибсов, моча которых отличалась характерным мышиным запахом и повышенным содержанием фенилпирувата [1080]. Это открытие навело на мысль, что и другие случаи умственной отсталости связаны с врожденными нарушениями метаболизма. Однако многочисленные исследования мочи умственно отсталых больных почти не дали результатов. Хотя и были открыты некоторые другие заболевания, например гомоцистинурия (см. ниже), в большинстве случаев умственной отсталости врожденных нарушений метаболизма, которые можно было бы обнаружить подобным способом, не было.

Заболевания соединительной ткани и костной системы, как правило, не связаны с врожденными дефектами метаболизма, однако есть исключения. Гомоцистинурия – заболевание, обусловленное нарушением метаболизма серусодержащей аминокислоты метионина вследствие недостаточности цистатионсинтазы печени. Симптомы можно объединить в три основные группы: 1) аномалии соединительной ткани и органов зрения-остеопороз, паучьи пальцы, воспаление коленных суставов, деформация хрусталика; 2) нарушения функций центральной нервной системы – в 50% случаев умственная отсталость; 3) тромбозы артерий и вен. Часть перечисленных симптомов совпадает с описанными при синдроме Марфана, который наследуется доминантно, но иногда встречается как спорадический случай вследствие вновь возникающей мутации. Вот почему синдром Марфана легко может быть принят за гомоцистинурию. Но даже отвлекаясь от этого обстоятельства, просто зная общую симптоматологию рецессивных ферментативных дефектов, трудно предположить, что все столь разные симптомы обусловлены дефектом одного конкретного фермента.

Клиническая диагностика нарушений метаболизма. Болезни, вызванные наследственными нарушениями метаболизма, встречаются довольно редко. Это значит, что даже активно работающий педиатр за все время своей практики встретится лишь с несколькими случаями, поэтому трудно ожидать от каждого врача постановки правильного исчерпывающего диагноза и, тем более, правильного лечения. В США и Европе существует несколько педиатрических центров, специализирующихся в области диагностики (в том числе пренатальной) и лечения отдельных заболеваний или небольших групп болезней, обусловленных наследственными повреждениями ферментов. Такая узкая специализация позволяет обеспечить высочайший на сегодня уровень медицинского обслуживания.

Однако долг каждого врача независимо от области его специализации (будь то общая терапия, педиатрия или медицинская генетика) - правильно диагностировать заболевания, вызванные наследственными нарушениями метаболизма. Ранняя диагностика важна не только в отношении болезней, для которых существует специальное лечение (разд. 4.2.2.9), но и в тех случаях, когда необходимо предотвратить рождение больных детей (пренатальная диагностика).

Методы изучения ферментативных нарушений. При изучении ферментативных нарушений пользуются методами энзимологии. Для выяснения генетической природы того или иного дефекта важны не только количественные изменения активности фермента, но и качественные различия в характеристиках нормального и измененного фермента.

Так, например, у больных детей с синдромом Леша—Найхана (30800) [1163] была обнаружена повышенная термолабильность гипоксантин-гуанин—фосфорибозилтрансферазы, а у детей с болезнью Фабри (сопряженной с дефектами фермен-

14 4. Действие генов

Таблица 4.2. Биохимические дефекты у человека, при которых обнаруживается перекрестно-реагирующий материал, что указывает на мутационное изменение фермента или белка [121]

Недостаточность псевдохолинэстеразы 1) («молчащий» фенотип)

Метахроматическая лейкодистрофия

Гликогеноз Мак-Ардла 1)

Ганглиозидоз Зандхоффа

Синдром Леша—Найхана

Неусвоение фруктозы I типа

Фенилкетонурия

Галактоземия

Недостаточность фибриногена

Мукополисахаридоз III В

Недостаточность протромбина

Недостаточность проконвертина 1)

Гемофилия А 1)

Гемофилия В 1)

Недостаточность фактора Стьюарта—Правера

Недостаточность фермента, стабилизирующего фибрин

Недостаточность фактора С4

Недостаточность сахарозоизомальтазы

Болезнь Тея—Сакса

1) Описаны также случаи без перекрестно-реагирующего материала.



Скачать документ

Похожие документы:

  1. БИБЛИОГРАФИЯ = Фогель Ф Мотульски А Генетика человека В 3-х т Т 3 Пер с англ – М Мир 1990 – 366 с Фогель Ф Мотульски А Генетика человека В 3-х т Т 3 Пер с англ – М Мир 1990 – 366 с

    Книга
    ... 294 336 378 420 ... Мира, 93. ЭЛЕКТРОННОЕ ОГЛАВЛЕНИЕ БИБЛИОГРАФИЯ = Фогель Ф., Мотульски А. Генетикачеловека: В 3-х т. Т. 3: Пер. с англ. – М.: Мир, 1990. – 366 с. 1 Фогель Ф., Мотульски А. Генетикачеловека: В 3-х т. Т. 3: Пер. с англ. – М.: Мир, 1990 ...
  2. «ОПАСНОЕ ЗНАНИЕ» В «ОБЩЕСТВЕ РИСКА» (век генетики и биотехнологии)

    Документ
    ... Альтерпрес,2002. 284 с. Фогель Ф., Мотульски А. Генетикачеловека: В 3-х М.: Мир, 1990. –378 с. Форрестер Дж. Мировая динамика Пер. с англ. Под ред. Д.М.Гвишиани ... будущего: роль этики 373 КРАТКАЯ БИБЛИОГРАФИЯ 389 1 Кальниш В.В., Ена А.И. ...
  3. Проект ingsat

    Документ
    ... Генетикачеловека. В 3-х т. Т. 1. Пер. с англ. М., Мир, 1989. 312 с.djvu Фогель Ф., Мотульски А. Генетикачеловека. В 3-х т. Т. 2. Пер. с англ. М., Мир, 1990. 378 с.djvu Фогель Ф., Мотульски А. Генетикачеловека. В 3-х т. Т. 3. Пер. с англ. М., Мир ...

Другие похожие документы..