textarchive.ru

Главная > Книга


4.3. Гемоглобин человека [119; 31; 97а]

Молекулу гемоглобина изучать легче, чем молекулу любого другого белка человека. Гемоглобин – основной белок эритроцитов, и для его выделения не требуется сложных биохимических методов. Неудивительно поэтому, что именно об этом белке мы знаем больше, чем обо всех остальных. Исследования по генетике гемоглобина человека, изучение аминокислотной последовательности и структуры его молекулы продвигались очень быстро. В молекулярной генетике человека они сыграли такую же роль, как изучение дрозофилы и бактериофагов в общей генетике. Большинство концепций, разработанных для этой системы, являются общими для других белков. Действительно, многие концептуальные принципы генетики человека можно иллюстрировать примерами из генетики гемоглобина.

4.3.1. История изучения гемоглобина

Серповидноклеточная анемия – «молекулярное» заболевание. Изучение гемоглобина человека началось с открытия наследственного заболевания – серповидноклеточной анемии. В 1910 г. Херрик [1121] обнаружил у студента-негра, страдающего анемией, особую аномалию эритроцитов: они были серповидной формы. Вскоре выяснилось, что такая патология довольно часто встречается у американских негров. Больные страдали от гемолитической анемии и частых болей в кишечнике и скелетных мышцах. Было показано, что больные серповидноклеточной анемией гомозиготны по гену, который в гетерозиготном состоянии (примерно у 8% американских негров) вызывает гораздо менее выраженное отклонение: присутствие в крови некоторого количества серповидных эритроцитов [1226].

Решающую роль в биохимическом и генетическом анализе этой болезни сыграла работа выдающегося химика Полинга,

4 Действие генов 71

Рис. 4.33. Диаграмма зонального электрофореза гемоглобинов при рН = 6,9. А Нормальная гомозигота (АА) Б Больной с серповидноклеточной анемией (SS) В Признак серповидноклеточности (AS) Г Смесь равных количеств гемоглобина А и гемоглобина S [1260] Стрелка указывает на стартовую точку электрофореза

опубликованная под программным заголовком «Серповидноклеточная анемия, молекулярное заболевание» [1260] (Полинг узнал об этой болезни от Кастла, известного гематолога и сына одного из пионеров генетики млекопитающих, и предположил, что ее причиной может быть дефект гемоглобина ) Он писал

«Данные, имевшиеся к началу нашей работы, указывали, что процесс образования серповидных эритроцитов может быть тесно связан с состоянием и природой гемоглобина в эритроцитах»

Авторы исследовали гемоглобин людей, в крови которых обнаруживались серповидные эритроциты, гемоглобин больных серповидноклеточной анемией и гемоглобин здоровых людей В работе использовали самый совершенный в то время метод анализа белков – зональный электрофорез по Тизелиусу (рис 4 33) Пики на рисунке соответствуют градиентам концентрации гемоглобина в определенном буфере, расположение этих пиков зависит от соотношения положительных и отрицательных зарядов в молекуле белка

«Результаты указывают на существование значительных различий в электрофоретической подвижности гемоглобина, выделенного из эритроцитов здоровых людей, и гемоглобина, выделенного из эритроцитов больных серповидноклеточной анемией»

У людей, в крови которых наряду с нормальными имеются и серповидные эритроциты, обнаружено 25-40% аномального гемоглобина, такого же как у больных серповидноклеточной анемией, остальной гемоглобин был неотличим от гемоглобина нормальных индивидов Эти данные подтверждали предположение о том, что больные серповидноклеточной анемией гомозиготны по гену, который находится в гетерозиготном состоянии у людей с признаком серповидноклеточности

«Эта работа показала, что молекула белка меняется при аллельном изменении единственного гена, контролирующего его синтез»

Замена одной аминокислоты В 1956 г Ингрэм работал в Кэмбридже, в той лаборатории, где до этого Перутц исследовал кристаллографию белков, Сэнгер определил аминокислотную последовательность инсулина, а Крик и Уотсон предложили свою модель структуры ДНК Ингрэму удалось точно определить, чем нормальный гемоглобин отличается от серповидноклеточного [1138] При гидролизе молекулы глобина трипсином, расщепляющим белки, образуется около 60 пептидов, которые были разделены в двумерной системе на бумаге в одном направлении с помощью электрофореза, а в другом – с помощью хроматографии Этим методом (его называют методом «отпечатков пальцев») удалось показать, что гемоглобин серповидных эритроцитов отличается от нормального по подвижности единственного пептида При дальнейшем анализе этого пептида выяснилось, что гемоглобин серповидных эритроцитов отличается от нормального только по одной аминокислоте, глутамино-

72 4. Действие генов

вая кислота в определенном положении заменена валином.

В молекуле глутаминовой кислоты по сравнению с молекулой валина имеется дополнительная карбоксильная группа. Эта разница в зарядах и обусловливает различия в электрофоретической подвижности нормального и серповидноклеточного гемоглобина.

Впоследствии, по мере совершенствования методов электрофореза, стали выявляться все новые и новые варианты гемоглобина. В настоящее время их известно более 400 [1194]. Следующими вехами в изучении гемоглобина следует считать установление его полной аминокислотной последовательности (Браунитцер и др., 1961) [1016] и трехмерной структуры [1165; 1265]. Позже стали понятны структурнофункциональные взаимоотношения, были обнаружены различные типы мутаций: делеции и сдвиг рамки считывания. Выделение мРНК гемоглобина позволило по-новому взглянуть на структуру и функционирование гена, открыло новые пути к пониманию механизма его действия.

Исследования гемоглобинов на молекулярном уровне продвигались очень быстро. В настоящее время известны полные нуклеотидные последовательности ряда генов гемоглобинов вместе с фланкирующими их последовательностями, мы хорошо понимаем организацию гемоглобиновых генов, изучена природа мутаций, затрагивающих гемоглобины, в особенности при талассемиях. Следующий раздел посвящен генетике гемоглобинов.

4.3.2. Генетика гемоглобина

Молекулы гемоглобина. Молекула человеческого гемоглобина состоит из четырех полипептидных цепей. Молекула гемоглобина обозначается общей формулой α2β2, которая показывает, что в состав молекулы входят две пары сходных цепей глобина [1348]. Большинство разновидностей гемоглобина человека имеют идентичные α-цепи и различаются по другим цепям. К каждой цепи глобина в специфическом участке присоединяется молекула небелковой природы - гемогруппа, или гем (рис. 4.34). Четыре глобиновые цепи, каждая со своим гемом, образуют функциональную молекулу гемоглобина, которая переносит кислород из легких в ткани. Молекула глобина построена из 140 с небольшим аминокислот, которые расположены в строго определенном порядке (рис. 4.35). Последовательность аминокислот в белке (например, в гемоглобине) считают его первичной структурой. Пространственное расположение соседних остатков называется вторичной структурой, а трехмерное расположение белковых субъединиц - третичной структурой (рис. 4.34). Термин четвертичная структура относится к взаимной организации четырех субъединиц в составе функционирующей молекулы.

Преобладающим типом гемоглобина у детей и взрослых является НbА, или гемоглобин взрослых (α2β2). Его отличительная черта - строение Р-цепи (рис. 4.35). α- и β-цепи различаются по многим аминокислотным остаткам. У всех взрослых есть небольшое количество (2-3%) гемоглобина НbА22δ2). Характерная для него δ-цепь отличается от β-цепи только по десяти аминокислотным остаткам. После рождения у всех детей обнаруживается также небольшое количество (меньше 1%) фетального гемоглобина HbF:α2γ2 (см. ниже), γ-цепь значительно отличается от α- и β-цепей. α-цепи НbА, НbА2 и HbF идентичны.

Существует несколько типов гемоглобинов, характерных для эмбрионального и фетального развития, ζ-цепи напоминают по аминокислотному составу α-цепи [1155], а ε-цепи похожи на β-цепи [1232]. ζ-цепи, вероятно, появляются раньше других в эмбриональном развитии. ζ- и ε-цепи исче-

4. Действие генов 73

Рис. 4.3.1. Диаграмма показывает трехмерное строение (3° структура) типичной глобиновой цепи, состоящей из восьми спиральных и шести неспиральных участков. Чтобы упростить сравнение различных глобиновых цепей, их спиральные фрагменты обозначены буквами от А до Н, а неспиральные участки - двумя буквами, например CD, FG и т. д. Черной волнистой линией показано пространственное расположение различных аминокислот (2° структура). Аминокислоты пронумерованы с N-конца, начиная с А1. Номер относится к конкретной аминокислоте, расположенной в данном положении, это могут быть разные аминокислоты в различных глобиновых цепях. Структурно эквивалентные остатки одинаково обозначаются во всех гемоглобинах независимо от вставки или делеции аминокислот. Обратите внимание на вставку небелковой цепи гема между Е7 и Е8. Аминокислотные остатки в позициях Е7 (гистидин), Е11 (валин) и HS2 (тирозин) особенно важны для функционирования гемоглобинов млекопитающих. Буквы М, V и Р в молекуле гема обозначают соответственно метиловую, виниловую и пропионовую боковые цепи [1265].

зают через 8-10 недель внутриутробного развития (рис. 4.36) [1364]. Затем преобладающим становится гемоглобин HbF(α2γ2), который отличается от других присутствием γ-цепи. Известно два типа γ-цепей: с аланином (Аγ) или с глицином (Gγ) в 136-м положении. Существует и третий тип γ-цепи с треонином вместо изолейцина в 75-м положении [1281; 1319]. Он встречается у 10-15% эмбрионов и, судя по всему, не связан с каким-либо нарушением. Гемоглобин α2β2 обнаруживается уже на 6-8 неделе развития плода [1319; 1364].

Синтез γ-цепей у эмбриона происходит в основном в печени и селезенке, но могут они синтезироваться и кроветворными клетками костного мозга. Наоборот, β-цепи, в детстве и в более зрелом возрасте синтезируются главным образом в костном мозге, однако синтез вне костного мозга также возможен [1364]. Различные типы гемоглобина перечислены в табл. 4.12.

Все нормальные гемоглобины человека, которые были исследованы, имеют идентичную трехмерную структуру (рис. 4.34), существенную для переноса кислорода. Все

74 4 Действие генов

Рис. 4.35. Первичная структура аминокислотной последовательности β-цепи нормального гемоглобина взрослого человека (гемоглобина А). Аминокислоты, участвующие в образовании характерных участков α-спирали, заключены в квадраты. Остатки аминокислот, не участвующие в образовании спирали, заключены в вытянутые прямоугольники. Показано место прикрепления гема. Специфическую аминокислотную последовательность β-глобиновой цепи полезно сопоставить с трехмерным строением молекулы, показанным на рис. 4.34.

Рис. 4.36. Онтогенез цепей гемоглобина человека до рождения и в первые несколько месяцев после рождения. Верхняя диаграмма отражает изменения синтеза различных цепей глобина в ходе развития. Нижняя диаграмма указывает на характерные места эритропоэза, меняющиеся в ходе развития. Наблюдается замечательное совпадение во времени синтеза ε- и ζ-цепей и эритропоэза в желточном мешке, синтеза γ-цепи и эритропоэза в печени и селезенке, синтеза β-цепи и эритропоэза в костном мозге [1230].

4 Действие генов 75

Таблица 4.12. Гемоглобины человека

Стадия

Гемоглобин

Структура

Эмбрион

Gower I

Gower II

Portland I

Плод

F

Взрослый

A

человек

глобиновые цепи различных гемоглобинов имеют общее эволюционное происхождение и возникли в результате последовательных дупликаций генов (см. разд. 7.2.3). Чем больше сходство между двумя цепями, тем позднее в эволюции произошла дупликация. Очевидно, цепи Аγ и Gγ, которые различаются по одной аминокислоте, дивергировали позже всех других, а дупликация генов β- и α-цепей произошла в весьма отдаленном прошлом.

Гены гемоглобина. Аминокислотная последовательность каждой глобиновой цепи кодируется своим собственным геном. В гаплоидном наборе у нормального человека присутствует по крайней мере по одному гену α, β, γ, δ, ε, ζ, и по крайней мере по два таких гена-в диплоидном наборе. В большинстве популяций человека ген α-цепи существует в дуплицированном состоянии, причем отличий между двумя α-генами не обнаружено [1350]. Имеются два гена γ-цепей Аγ и Gγ, которые различаются по кодону, детерминирующему аминокислотный остаток в 136-м положении. Некоторые гены Аγ несут необычный кодон, в результате в 75-м положении изолейцин замещен на треонин (TАγ).

Синтез небелковой гемогруппы также контролируется генами, поскольку они кодируют ферменты, обеспечивающие биосинтез гема.

Различные гены глобинов, соответствующие им глобиновые цепи и различные нормальные гемоглобины приведены в табл. 4.12 и на рис. 4.37.

Была подробно исследована структура всех генов глобинов, опубликованы их полные нуклеотидные последовательности [981; 1041; 1200; 1273; 1304; 1314]. Подобно многим генам млекопитающих, гены глобинов у человека образуют мультигенное семейство и расположены на хромосомах в составе двух кластеров (рис. 4.38, 4.39). α-кластер глобиновых генов занимает 25000 пар оснований (25 т. п. н.) в коротком плече 16-й хромосомы. Семейство γ-β-δ-генов глобина расположено в коротком плече 11-й хромосомы на участке длиной 60 т. п. н. Пока остается неизвестным генетический механизм, регулирующий координированное функционирование генов на двух различных хромосомах, в результате которого образуется равное количество субъединиц α- и β-у-типа. В α-кластере структурные гены расположены в следующем порядке в направлении от 5' к 3': ген эмбриональной ζ-цепи, псевдоген ζ-цепи,

Рис. 4.37. Нормальные глобиновые гены человека. Цепи β-, δ-, ε- и ζ-глобинов кодируются уникальными генами. Гены, кодирующие цепи аи у-глобинов, дуплицированы. Две γ-цепипродукты генов НbАγ и HbGγ-отличаются друг от друга по одному аминокислотному остатку, аланину (А) или глицину (G) в положении 136. Не обнаружено различий между двумя генами Нbα. Тетрамеры, образующиеся при формировании гемоглобина, показаны в нижней части рисунка.

76 4. Действие генов

Рис. 4.38. Расположение на хромосоме (16р) и организация а-глобинового кластера человека. Ψ, псевдоген; IVS, интроны (вставочные последовательности, обозначенные белыми прямоугольниками). 31, 32, 99 - число пар оснований в интронах [972].

Рис. 4.39. Расположение на хромосоме (11р) и организация β-глобинового кластера человека. Обозначения см. на рис. 4.38 [972].

псевдоген α-цепи и два идентичных гена α-цепи (рис. 4.38). Выяснено расположение генов и в β-кластере: ген эмбриональной ε-цепи, два гена фетальных γ-цепей (Аγ и Gγ), псевдоген β-цепи, ген δ-цепи и ген β-цепи (рис. 4.39). Порядок расположения генов в этих кластерах совпадает с очередностью их экспрессии в онтогенезе. По последовательности нуклеотидов псевдогены мало отличаются от своих функциональных гомологов. Однако в результате различных мутаций стала невозможной их транскрипция и, следовательно, экспрессия. Предполагается, что псевдогены возникли в результате дупликации, после которой их экспрессия перестала быть необходимой для нормального функционирования организма. Ген δ-глобина, продукт которого составляет лишь 2-3% всего гемоглобина, можно считать геном, который находится в переходном состоянии к псевдогену.

Все глобиновые гены во многом сходны по своей функциональной организации. Каждый из них имеет в составе три кодирующие последовательности, т. е. три экзона. Между 1-м и 2-м экзонами и между 2-м и 3-м экзонами расположены уникальные вставочные последовательности, или интроны, известные соответственно как IVS-1 и IVS-2 (от англ. intervening sequences) (рис. 4.38, 4.39, 4.40). Интроны транскрибируются вместе с экзонами, так что в первичном транскрипте представлены как кодирующие, так и некодирующие последовательности соответствующего гена. Вставочные последовательности вырезаются в ходе процессинга, который происходит в ядре, в результате конец первого экзона соединяется с экзоном 2, а конец второго экзона - с экзоном 3, при этом образуется функциональная мРНК, которая и служит матрицей для синтеза гемоглобина на рибосомах (рис. 4.40). Две вставочные последовательности идентичны у различных генов γ-δβ-кластера, но отличаются от более коротких интронов генов α-кластера. Детали процесса сплайсинга пока не ясны, однако для его изучения оказались весьма полезными мутации, которые вызывают β-талассемии (см. ниже) и обусловлены нарушениями вырезания интронов. Все интроны начинаются с нуклеотидов GT (донорный сайт) и кончаются динуклеотидом AG (акцепторный сайт) - эти динуклеотиды состав-

4. Действие генов 77

Рис. 4.40. Схематическое изображение гена Нbβ, первичного транскрипта этого гена, мРНК Нbβ и полипептидной цепи β-глобина. Показаны регуляторные последовательности, экзоны и интроны Последовательность poly (А) добавляется к транскрипту, интроны вырезаются.

Рис. 4.41. Краткая схема этапов синтеза белка на примере гемоглобина. Нуклеотиды ДНК гена гемоглобина транскрибируются (транскрипция) ферментом РНК-полимеразой с образованием гетерогенной ядерной РНК (гяРНК) Интроны, поскольку они не содержат структурную информацию, вырезаются. мРНК переносится из ядра (темно-серое) в цитоплазму (светло-серая), где на рибосомах осуществляется синтез глобинов (трансляция). Он делится на следующие этапыинициацию, элонгацию и терминацию. К образующейся в результате трансляции полипептидной цепи глобина присоединяется гем. Четыре глобиновые цепи объединяются, образуя функциональную молекулу гемоглобина.

ляют часть так называемых обобщенных последовательностей сайтов сплайсинга. Более подробно см. в [1041 и 1238]. Некоторые детали этапов синтеза гемоглобина (от гена до белковой молекулы) представлены на рис. 4.40 и 4.41.

Генетические доказательства несцепленности генов α- и β-глобинов появились задолго до определения структуры кластеров этих генов. Было показано, что если один из родителей является двойной гетерозиготой с мутациями в генах α- и β-глобинов, а другой - нормальной в отношении гемоглобина гомозиготой, то в потомстве выявляются четыре фенотипа: нормальный, с измененным α-глобином, с измененным β-глобином и двойной мутант (рис. 4.42)

78 4. Действие генов

Рис. 4.42. Генетический анализ потомства от брака двойной гетерозиготы по Hbα (αHopkins-2) иHbβ (Hbβs) с нормальным индивидом. Поскольку гены Hbα и Hbβ расположены в разных хромосомах, возникают всевозможные комбинации хромосом и в потомстве обнаруживаются четыре класса в равном соотношении: нормальный Hb A; Hb A/S; признак серповидноклеточности; Hb A/Hb Hopkins-2: признак Hopkins-2; гетерозиготность Hb S/Hb Hopkins-2 проявляется так же, как у больного родителя. Если бы гены Hbα и Hbβ были тесно сцеплены, родительские фенотипы наблюдались бы в незначительной доли потомства, возникая только в результате мейотической рекомбинации (разд. 3.4). Чем теснее сцепление, чем меньше вероятность рекомбинации (см. рис. 4.43).

[1014]. Если бы гены α- и β-глобинов были тесно сцеплены, то в потомстве наблюдались бы генотипы Hbαx и НbβХ, но не было бы двойных мутантов или нормальных индивидов. Подобным образом генетически доказано тесное сцепление генов δ- и β-глобинов: если один из родителей был двойной гетерозиготой с мутациями в генах β- и δ-цепей, то рекомбинантов среди детей не было [1013] (рис. 4.43). Открытие гемоглобина Lepore - продукта слияния генов δ- и β-цепей - послужило биохимическим доказательством сцепления этих генов в составе одной хромосомы [1350] (см. ниже). Вывод о сцеплении генов γ- и β-глобинов был сделан на основании исследований гемоглобина Kenya, ген которого образуется при слиянии этих двух генов.

Промоторы. Перед каждым глобиновым геном расположены три различные последовательности. Они близки по структуре у разных генов и, судя по всему, участвуют в регуляции транскрипции (рис. 4.40). Их называют промоторными элементами [1041; 1238]. В их число входит ТАТА или АТА-блок (последовательность Хогнесса), который находится на расстоянии в 30 пар нуклеотидов от точки начала транскрипции. Эта последовательность представляет собой элемент промотора, необходимый для точной инициации транскрипции. Другая последовательность, СААТ, расположенная за 80 пар оснований от стартовой точки, служит сайтом узнавания для РНКполимеразы. Третий, дистальный, элемент локализован за 80-100 нуклеотидов, имеет характерную последовательность PuCPuCCC (Pu-пурин). До сих пор неизвестно, требуются ли для образования глобинов «энхансеры» (усилители)-генетические элементы, влияющие на эффективность транскрипции независимо от их позиции или ориентации.

Последовательности, расположенные за геном. Терминация транскрипции осуществляется примерно через 1000 пар оснований после 3-го экзона гена β-глобина (рис. 4.40). Сигналом расщепления РНК эндонуклеазой служит последовательность AAUAA, к которой затем присоединяется polyA-«хвост» длиной в 220 нуклеотидов. Она не



Скачать документ

Похожие документы:

  1. БИБЛИОГРАФИЯ = Фогель Ф Мотульски А Генетика человека В 3-х т Т 3 Пер с англ – М Мир 1990 – 366 с Фогель Ф Мотульски А Генетика человека В 3-х т Т 3 Пер с англ – М Мир 1990 – 366 с

    Книга
    ... 294 336 378 420 ... Мира, 93. ЭЛЕКТРОННОЕ ОГЛАВЛЕНИЕ БИБЛИОГРАФИЯ = Фогель Ф., Мотульски А. Генетикачеловека: В 3-х т. Т. 3: Пер. с англ. – М.: Мир, 1990. – 366 с. 1 Фогель Ф., Мотульски А. Генетикачеловека: В 3-х т. Т. 3: Пер. с англ. – М.: Мир, 1990 ...
  2. «ОПАСНОЕ ЗНАНИЕ» В «ОБЩЕСТВЕ РИСКА» (век генетики и биотехнологии)

    Документ
    ... Альтерпрес,2002. 284 с. Фогель Ф., Мотульски А. Генетикачеловека: В 3-х М.: Мир, 1990. –378 с. Форрестер Дж. Мировая динамика Пер. с англ. Под ред. Д.М.Гвишиани ... будущего: роль этики 373 КРАТКАЯ БИБЛИОГРАФИЯ 389 1 Кальниш В.В., Ена А.И. ...
  3. Проект ingsat

    Документ
    ... Генетикачеловека. В 3-х т. Т. 1. Пер. с англ. М., Мир, 1989. 312 с.djvu Фогель Ф., Мотульски А. Генетикачеловека. В 3-х т. Т. 2. Пер. с англ. М., Мир, 1990. 378 с.djvu Фогель Ф., Мотульски А. Генетикачеловека. В 3-х т. Т. 3. Пер. с англ. М., Мир ...

Другие похожие документы..